la maladie et la maladie de Lyme : identification de
Borrelia burgdorferi dans Morgellons
Middelveen chez les patients présentant une maladie Marianne J1
, Cheryl Bandoski2
, Jennie Burke3
, Eva Sapi2
, Filush Katherine R2
, Yean Wang3
,
Agustin Franco3
, Peter J Mayne1 et Raphael B Stricker1,4*
Résumé
Contexte : maladie Morgellons (MD) est un trouble caractérisé par la peau complexe ulcerating lésions qui ont
saillants ou filaments intégré. De nombreux cliniciens se reporter à cette condition comme parasitoses délirant ou
infestation délirant et examiner les filaments à être introduit les fibres textiles. En revanche, de récentes études indiquent que MD est
une véritable maladie somatique associés à l'infection à tiques, que les filaments sont la kératine et du collagène dans la composition
et qu'ils sont le résultat de la prolifération et l'activation de kératinocytes et fibroblastes de la peau. Auparavant, les spirochètes
ont été détectées dans les échantillons provenant de quatre minidisc dermatologiques les patients, ce qui prouve qu'un
processus infectieux.
Méthodes et résultats : fondée sur la culture, l'histologie, immunohistochimie, microscopie électronique et les tests moléculaires,
nous présentons des preuves corroborantes de spirochetal infection dans un groupe plus vaste de 25 MD les patients. Indépendamment de
réactivité sérologique de Lyme, tous les patients dans notre groupe d'étude a démontré les preuves histologiques de spirochetal épithéliales
infection. Solidité des preuves fondées sur d'autres tests variaient entre les patients. Les spirochètes identifiés comme Borrelia
souches par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et/ou l'hybridation d'ADN in situ ont été détectées en 24/25 de notre étude des
patients. La peau des cultures contenant Borrelia spirochètes ont été obtenus à partir de quatre patients, démontrant ainsi que
les organismes présents dans les spécimens dermatologique étaient viables. Les spirochètes identifiés par PCR comme Borrelia burgdorferi
ont été cultivés à partir de sang chez sept patients et de les sécrétions vaginales chez trois patients, démontrant
l'infection systémique. En se fondant sur ces observations, un système de classification clinique pour MD est proposé.
Conclusions: notre étude à l'aide de plusieurs méthodes de détection confirme que MD est une véritable maladie somatique associés
à Borrelia spirochètes qui cause la maladie de Lyme. D'autres études sont nécessaires pour déterminer le traitement optimal
pour ce spirochète-associés dermopathy.
Mots-clés : maladie Morgellons, maladie de Lyme, Borrelia burgdorferi, spirochètes,
maladie Morgellons fond (Dermopathy MD) est un complexe dermopathy caractérisé
par l'apparition spontanée de
lésions cutanées de guérison lente qui contiennent des filaments multicolores soit
couché sous, intégrés ou en saillie sur la peau
(figure 1A-C) [1-9]. Les patients peuvent également montrer constitutionnel,
affections musculo-squelettiques et neurocognitif des symptômes qui
y sont associés avec la maladie de Lyme (ML) et tiques
coinfections. La présence de ces symptômes suggère
une origine infectieuse de l'dermopathy et possible
vectorisation par les tiques [4,7,8].
Des études antérieures ont constaté que les patients
seroreactivity MD démontrent pour Borrelia burgdorferi (BB) les antigènes et
multisystémiques symptômes compatibles avec LD, suggérant
une étiologie spirochetal [4,7,8]. En outre, histologiques, la microscopie électronique
et PCR études de tissu dermatologique
contenant des inclusions d'filamenteux quatre MD patients
ont confirmé la présence de bb sensu stricto les spirochètes
[6,7]. Succès La culture bactérienne sur les spirochètes mobiles dans
BSK-H inoculé avec MD tissu dermatologique
Rstricker@usmamed.com * Correspondance : 1'
International Lyme and Associated Diseases Society, Bethesda, MD, É.-U.)
4
450 Sutter Street, Suite 1504, San Francisco, CA 94108, USA
Liste complète des informations sur l'auteur est disponible à la fin de l'article
© 2015 Middelveen et al.; licensee BioMed Central. C'est un libre accès article distribué sous les termes de la
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Middelveen et al. BMC dermatologie (2015) 15:1
DOI 10.1186/s12895-015-0023-0
ont démontré la viabilité des spirochètes dans deux de ces
patients, et une culture a été confirmé comme Bb sensu
stricto par analyse de PCR [7]. Une étude de cas sur un MD patient
en Australie a rapporté que endpoint PCR et
alignement local de base
B (2,5 μg/ml) (Sigma-Aldrich), comme décrit auparavant [11].
Des inocula de cultures de sang ont été préparées comme suit : 10
ml de sang total ont été recueillies par la ponction veineuse
et laissé à température ambiante pendant 10 à 15 minutes pour permettre à la
coagulation, suivie par une centrifugation à faible vitesse pour séparer
les cellules rouges du sang. Le sérum et certaines cellules sanguines juste en dessous de la
couche sériques ont été utilisées comme inoculum. Le sérum/
préparation de cellules sanguines a été inoculé dans le BSK moyennes.
Pour d'autres cultures, ensemble de scabs retiré du patient,
grattage cutané de petites lésions retirées par une
lame scalpel, ou les échantillons vaginaux recueillies par écouvillonnage
dans le vagin avec un coton-tige stérile ont été
inoculés dans la BSK moyennes. Les cultures ont été incubées
dans un Oxoid bocal anaérobie (Thermo Scientific) contenant
un sachet AnaeroGen (Thermo Scientific) afin de fournir un
environnement anaérobie à 32°C.
On a examiné des échantillons de liquide de culture par champ lumineux et/ou de microscopie en champ sombre
pour les spirochètes mobiles visible chaque semaine jusqu'à
4 semaines. Les cultures ont été traitées pour l'imagerie et la PCR
par centrifugation du fluide à 15 000 g pendant 20 minutes, afin de
concentrer les spirochètes, retenant le pellet et jeter
le surnageant.
Dieterle et anti-Bb immunocoloration
spécimens dermatologique et/ou culture pellets de
patients ont été traités pour la coloration spécialisé à l'une ou l'autre
McClain Laboratories LLC, Smithtown, NY; Interscope
Laboratories, Interscope pathologie médicale groupe,
Conogo Park, CA; ou l'Université de New Haven,
New Haven, CT. La coloration au nitrate argenté Dieterle a été exécutée
en mode Interscope laboratoires ou McClain Laboratoires.
L'immunocoloration Anti-Bb a été réalisée à
l'université ou les laboratoires McClain de New Haven.
Pour les échantillons soumis à McClain laboratoires
pour anti-Bb immunocoloration, le protocole suivant a été
utilisé : fixés au formol et inclus en paraffine
tissus dermatologique et pastilles de culture ont été sectionnés et immunocolorées
utilisant un lapin non conjugués anti-Bb anticorps polyclonaux
(Abcam20950) et alors ab incubés avec une
sonde de la phosphatase alcaline (Biocare Medical #jusqu'536L)
suivie d'un substrat chromogène (Biocare Medical
#FR805counterstained CHC) et à l'hématoxyline. Des
témoins positifs et négatifs des deux Dieterle et
immunostains anti-BB ont été préparés aux fins de comparaison
à l'aide de coupes du foie de souris non infectés et les souris expérimentalement
inoculés avec BB, comme décrit précédemment
[12]. La coloration est titré à définir
dilutions d'anticorps optimale. Aux fins de comparaison, les contrôles de la culture les
pellets de bactéries Gram-positives mixtes et mélangé
les bactéries Gram-négatives, et les sections de la
peau normale de l'homme ont également été examinés pour déterminer de possibles réactivité croisée
avec des
microorganismes dermatologiques couramment rencontrés.
Pour les échantillons soumis à l'Université de New
Haven, anti-Bb la coloration par immunofluorescence a procédé
comme suit : fixés au formol et inclus en paraffine MD
ont été traitées pour des sections de coloration et imagerie comme
décrit précédemment [13]. Dermatologique spécimens ont été
bloqués dans formalinfixed la paraffine et sectionnés par McClain Laboratoires.
Liquide de culture a été fixé avec de l'acétone à -20°C
sur SuperFrost™(Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA). Échantillons fixés, tant dermatologique
sections et fluide de la culture fixe, ont été pré-incubées avec
10% de sérum de chèvre normale (Thermo Fisher Scientific) dans du PBS
contenant 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) (Sigma Aldrich,
St. Louis, MO) pendant 30 minutes pour bloquer non spécifique
liaison de l'anticorps secondaire. les diapositives
ont été ensuite lavées avec du PBS contenant 0,5% de BSA et
puis incubées pendant 1 heure avec de l'isothiocyanate de fluorescéine
(FITC) marqué à l'anticorps polyclonaux spécifiques Borrelia
(Thermo Fisher Scientific, # 73005) à une dilution 1:50 dans
PBS contenant de la BSA 1%, pH 7,4 suivi d'un lavage
et ensuite contre-colorées avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole
(DAPI) pendant 10 minutes. Pour le contrôle négatif
échantillons, anti-anticorps spécifiquement ciblée a été remplacé
avec des IgG de lapin normal (Vector Laboratories, Burlingame,
CA, # I-1000). Les images ont été obtenues en utilisant fluorescent
microscopy. La microscopie électronique
Les échantillons pour la microscopie électronique à balayage (MEB) et la transmission
microscopie électronique (TEM) ont été transmis à la
Facilité Electron Microscopy, Département des Sciences des Matériaux
et de génie, Université Clemson, Anderson, Sud
Carolina. Les procédures ont été réalisées comme décrit précédemment
[6,7].
Pour SEM, pastilles de culture, fixés dans tamponnée glutaraldéhyde à 2,5%
ont été lavées dans du tampon et déshydraté dans
une série graduée de concentrations d'éthanol, suivie par
immersion dans hexaméthyldisilazane pendant 5-15 minutes
puis séché à l'air à température ambiante. Les échantillons secs
ont été montés sur Al supports et ne ont pas revêtu, mais
placé dans un microscope Hitachi TM3000 (Tokyo,
Japon) et portant une image dans le mode à pression variable.
Par TEM, des échantillons fixées au glutaraldéhyde ont été lavées dans
tampon et déshydraté dans une série graduée de concentrations d'éthanol.
Les échantillons ont été immergés dans un mélange 50:50 de
LR résine blanche et 100% d'éthanol enrobage pendant 30 minutes,
suivie par de la résine LR blanc pur jusqu'à ce qu'ils se installent
sur le fond du flacon. des échantillons de résine étaient immergés
placé dans la résine pure dans des capsules de faisceau et polymérisé
à 60 ° C pendant une nuit. Les articles ont été coupés sur une Ultracut E
microtome (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) produisant
sections 60 à 90 nm d'épaisseur, et ont été placés sur
des grilles de cuivre puis colorées dans de l'acétate d'uranyle pendant 20 minutes.
L'imagerie a été effectuée en utilisant un microscope Hitachi 7600.
L'analyse moléculaire
PCR - Université de New Haven
L'ADN a été extrait à partir de pastilles et / ou dermatologique de la culture
par lyse de tissu pendant une nuit dans 180 pi de lyse tissulaire
tampon (Qiagen) et 20 ul de proteinase K (Qiagen) à 56 ° C
dans un bain d'eau et de phénol secouant: extraction chloroforme
le jour suivant. L'ADN a été remis en suspension dans 50 à 100 ul 1X
Tampon TE.
Un essai TaqMan publié ciblant un fragment 139 pb
du gène codant pour l'ARNr 16S de Borrelia a été utilisé pour
la détection de Borrelia dans l'ADN extrait d'un patient
les échantillons [14]. Les réactions ont été effectuées dans un volume final
et de 20 ul étaient composés de 900 nM de chaque amorce, 200 nM
de la sonde, et 10 pi de Maître 2X PCR TaqMan Universal
Mix (Applied Biosystems). Les amplifications ont été réalisées
sur un système CFX96 Real-Time (Bio-Rad) et le cyclisme
conditions consistaient en 50 ° C pendant 2 minutes, 95 ° C pendant 10 minutes,
suivie par 40 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes et
60 ° C pendant 60 secondes. Les signaux fluorescents ont été enregistrés
CFX96 utilisant le logiciel en temps réel et le seuil était Cq
régler automatiquement. Les réactions ont été effectuées en triple.
Les contrôles positifs et négatifs ont été menées simultanément.
Le contrôle positif était souche stricto B-31 de Bb. Quatre
contrôles négatifs ont été utilisés: l'eau, le prépuce humain normal,
peau normale à partir de deux patients de Lyme, et normal
écorcher d'un patient Morgellons. Borrelia ADN ne était pas
détecté dans aucun des témoins négatifs.
Amorces PCR nichée pour l'ARNr 16S, flagelline (FLA),
OspC, uvrA et pyrG gènes ont été utilisés comme précédemment
décrit [15-17]. Les réactions ont été effectuées dans un finale
volume de 50 pi en utilisant 10 pi de matrice d'ADN. Les concentrations finales
étaient 2X tampon B (Promega), 2 mM de MgCl2,
0,4 mM dNTP mix, 2 uM de chaque amorce, et 2,5 U
La polymerase Taq (Invitrogen). Amorces "extérieur" ont été utilisés
dans la première réaction. Amorces «interne» ont été utilisés pour la
réaction imbriquée, dans laquelle 1 pl de produit de PCR à partir de la
La première réaction a été utilisé comme matrice pour la seconde. Cyclisme
paramètres étaient les suivants: 94 ° C pendant 5 minutes, puis
par 40 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 1 minute, annelage
pendant 1 minute (température basée sur le jeu d'amorces
utilisé), et l'extension à 72 ° C pendant 1 minute, avec une finale
étape d'extension à 72 ° C pendant 5 minutes. Les produits de PCR
ont été visualisées sur 1-2% des gels d'agarose.
Séquençage de Sanger a été utilisé pour l'analyse de gènes. Les produits de PCR
ont été extraits à partir des gels d'agarose en utilisant le QIAquick
Gel Extraction Kit (Qiagen) selon le
les instructions du fabricant. Les éluats provenant de chaque échantillon
ont été séquencés dans les deux directions à l'aide des amorces qui
les produits générés. Les séquences obtenues ont été comparées
en recherchant la base de données GenBank (National Center for
Biotechnology Information) en utilisant une analyse BLAST. Séquence
alignement (Clustel W) et phylogénétique de neighbor-joining
analyses ont été effectuées en utilisant la version MEGA 5. Soutien Arbre
a été évaluée par l'amorçage de 500 répétitions.
PCR - biologiques australienne
Échantillons dermatologiques et / ou de pastilles de culture étaient
concentré par centrifugation et stabilisé avec AL
tampon (Qiagen). Les échantillons ont été envoyés à l'Australie
Biologiques pour la détection de Borrelia par ciblage PCR en temps réel
le gène ARNr 16S et le point final PCR ciblant le
rpoC gène, comme décrit précédemment [8,18]. L'Eco ™
Système PCR en temps réel avec la version du logiciel 3.0.16.0
a été utilisé. L'ADN a été extrait de la dermatologique
spécimens et les pastilles de culture en utilisant le QIAamp
Mini Kit ADN (Qiagen). Les échantillons ont été analysés en double
avec des contrôles positifs et négatifs en utilisant les amorces
pour les Borrelia ARNr 16S et du gène rpoC cibles, comme
précédemment décrit [8,18]. Profils thermiques pour toutes les analyses
ont été effectuées avec incubation pendant 2 minutes à
50 ° C, l'activation de la polymérase pendant 10 minutes à 95 ° C, puis
Vélo PCR pendant 40 cycles de 10 secondes à 95 ° C chute de
60 ° C maintenue pendant 45 secondes. L'ampleur de la PCR
signal généré (AR) pour chaque échantillon a été interprété comme
soit positive ou négative par rapport au positif et
témoins négatifs.
Les produits de PCR ont été visualisés sur 1-2% des gels d'agarose et
extrait à partir des gels en utilisant le QIAquick Gel Extraction
Kit (Qiagen) selon les instructions du fabricant.
Séquençage de Sanger a été utilisé pour l'analyse de gènes, tel que décrit
précédemment [18].
Balises moléculaires Sib
Dr Alan MacDonald conçu les séquences d'ADN et
généreusement offert les balises moléculaire sondes d'ADN de Bb.
Sonde FlaB, une séquence de 23 nucleotides, a été dérivée à partir de
la BB0147 Bb cadre de lecture ouvert (ORF) de la flagelline B
gène qui contient plus de 1000 nucleotides. Nucléotide
recherche BLAST de la séquence nucléotidique sonde 23
divulgués sans résultat autre que celui de Bb BB0147. Sonde
740 est dérivée de la Bb ORF BB740 représentant une
Bb intérieure protéine de la membrane cellulaire, et un BLAST nucléotidique
la recherche n'a révélé aucun matchs autres que celui de la Bb ORF
BB740.
Bb coloration de l'ADN et la détection de balises moléculaires
a été effectuée par le protocole suivant, comme décrit précédemment
[12]. Les sections de paraffine d'échantillons dermatologiques
et de boulettes de culture ont été complètement décirées par cuisson à
60 ° C, puis immergé dans de série 100% bains de xylène, suivie
par immersion en série par 100% d'éthanol, 90% d'éthanol,
80% d'éthanol et H2O distillée, puis séchées à l'air. Fixé
les coupes ont été immergées dans 20 ul de travail balise d'ADN
solution. Spécimens sectionnées étaient couverts de
coupe en plastique d'un sac de congélation Ziploc puis ont été chauffés
à 90 ° C pendant 10 minutes pour dénaturer tout ADN et l'ARN.
La chaleur a été réduite à 80 ° C pendant 10 minutes, puis les échantillons
refroidi progressivement à la température ambiante. Les lames colorées
ont été lavées dans du PBS, et recouvert de 30% de glycérol
et une lamelle de verre, puis examiné en vertu d'un Fluor EPI
microscope. Coloration des spécimens de recherche a été effectuée
à côté de la coloration des contrôles positifs et négatifs. Positif
contrôles consistaient en une souche Bb connu intégré dans
agarose, fixés à la formaline et sectionné, ainsi que expérimentalement
Bb-infecté sections de foie de souris. Le négatif
contrôle est composée de sections de foie de souris non infectées.
Résultats
L'examen histologique - spécimens dermatologiques
Tous les patients ont été diagnostiqués cliniquement avec MD par un
professionnel de la santé sur la base de la présence de lésions de la peau
et / ou des sensations de la peau ramper avec filaments intradermiques
qui étaient visibles avec un microscope à main, comme
décrit dans les publications précédentes [4-9]. Le dermatologique
matériau qui a rencontré notre critère diagnostique était
principalement sous la forme de cals intégré avec des filaments,
dont beaucoup étaient bleu ou rouge. Callosités MD étaient facilement
retiré de patients car ils sont composés de épaissie
peau qui se est séparé du derme à la
stratum basale. L'examen histologique de sections
couches épidermiques révélées de la couche basale à la
stratum corneum. Dans les callosités MD, collagène et filaments de kératine
pourrait être considéré distribué dans toute la épidermique
tissu ou projette depuis la couche basale
vers le derme.
Spécimens dermatologiques constituées par un matériau de cal
des patients suivants ont été soumis à histologique
sectionnement et l'examen: 1-4, 8, 10-13, 15, 16,
18-20, 22, 23, 25. sections de biopsie ont été soumis à
examen histologique des patients 24. Les articles de cheveux
bulbes folliculaires et des gaines de folliculaires attachés plutôt
callosités que sectionnés ont été soumis pour le patient 5.
Les échantillons provenant de patients 6, 7, 9, 14, 17 et 21 ont été utilisés
pour la culture et / ou la détection de PCR seulement.
Toutes les coupes histologiques ont été examinés à 400X et
Grossissement 1000X. Dans lames colorées avec Dieterle argent
tache nitrates et / ou des anticorps anti-Bb, en coupe
filaments incorporés dans les cellules épithéliales ont été observées chez
tous les échantillons de matériau de cal et dans le matériau de biopsie
24. Tous les patients de filaments ont montré le même
morphologie: un bulbe creux entouré par un cortex solide.
Matériel filamenteux démontré aucune caractéristique
compatible avec des éléments tels que des hyphes fongiques, ou de toute
caractéristiques de parasites connus tels que microfilaires.
Dieterle coloration de nitrate d'argent bactéries révélées morphologiquement
compatible avec les spirochetes Borrelia à 17/19
les patients (tableau 2). Spirochètes positivement colorées étaient
observée dans les sections de spécimens dermatologiques
pour les patients soumis 1-4, 8, 10-13, 15, 16, 18, 19, 20, 22
et 23 (figure 2A). Pas de spirochètes ont été observés pour les patients
5 ou 24. 5 patients ne avait sectionné bulbes folliculaires
et gaines soumis et le patient 24 eu des coupes de biopsies
soumis. Ces sections de biopsie démontré bactérienne
formes compatibles avec variantes kystiques de BB.
Anti-Bb coloration immunohistochimique était réactive
toutes les coupes histologiques de spécimens dermatologiques
soumis, y compris les follicules et les gaines de folliculaires
à partir de 5 patients et les deux coupes de biopsies provenant de patients
24 et 25 (100%). Spirochètes individuels étaient discernables
dans bon nombre de ces échantillons (figure 2B). La coloration de
Spirochètes Sib a été positive dans le foie de souris infectée
échantillons. Il n'y avait pas immunocoloration Bb significative
du contrôle Bb négatif foie de souris, le Gram positif mixte
culot bactérien ou de la peau humaine normale. La coloration de
sections de Gram négatif mixtes du Gram négatif
culture culot a montré que la faiblesse fond
coloration. Dans les études de contrôle de l'anti-Bb immunocoloration
réalisée à l'Université de New Haven, l'anticorps
réagi avec Bb mais pas avec Treponema denticola.
Bb SPIROCHETES dans un cal échantillon de patient 2
ont été détectés par SEM et les callosités en coupe de
les patients 1 et 2 par TEM rapportés comme précédemment [6].
Culture - observations générales
Les cultures ont été effectuées sur la peau, du sang et / ou vaginal
spécimens prélevés directement à partir de patients 3, 4, 6-9, 13, 14,
17, 21 et 24. Les micro-organismes viables ont été observés dans motiles
toutes les cultures à 4 semaines d'incubation à l'exception de la peau
la culture de la prise de patients Numéro 6. organismes mobiles
affiché variation morphologique, allant de sphérules
à plus de bactéries de forme hélicoïdale. Aucun des échantillons
pourraient être repiquées sur gélose au sang, même en anaérobie
conditions, et il n'y avait pas de contamination par couramment
Gram positif aérobie rencontrées. Certains
cultures avaient très peu d'organismes, et la documentation des
la croissance par la photographie était difficile en raison de morphologique
variation. Certaines cultures ont donc été concentrés
par centrifugation et colorées avec Dieterle
coloration à l'argent de nitrate et anti-Bb immunocoloration pour de plus amples
caractérisation.
culture de la peau
Dermatologiques spécimens ont été soumis pour la culture de
patients 3, 4, 6, 9, 13 et 21. L'examen de fluide de culture
à 4 semaines d'incubation révélé spirochètes mobiles, à l'exception
pour la culture d'un patient 6. La culture d'un patient 9
a révélé peu de croissance, mais une longue spirochète mobiles était
observée. Dieterle coloration à l'argent de nitrate des cultures de peau
a été effectuée sur des échantillons provenant de patients 3, 6 et 13.
Ces échantillons ont montré une coloration positive à la fois
sphérules et des spirochètes compatibles avec morphologique
formes de Borrelia. Tous les échantillons ont démontré fortement
Bb immunocoloration polyclonaux positif des bactéries
présenter ainsi que les débris cellulaires environnante. Cette
peut être dû à sécrétées exoantigènes, antigènes
publié par lysé Bb, ou la présence de Bb intracellulaire
l'infection. Les données sont résumées dans le tableau 3.
spirochètes, afin de vérifier la présence de spirochètes une
centrifugé culot de culture a été soumis à SEM. SEM
révélé que SPIROCHETES avec des caractéristiques morphologiques
compatible avec Bb étaient présents dans le culot de la culture
(Figure 2C).
L'hémoculture
Des échantillons de sang pour la culture ont été prélevés chez des patients 3,
4, 7, 8, 13, 14, 17 et 24. Les bactéries mobiles avec spirochetal
morphologie ont été observés dans le fluide de culture à partir de
les huit patients. Dieterle coloration au nitrate d'argent et
anti-Bb immunocoloration a été effectuée sur des cultures de sang
concentrées par centrifugation à partir de ces patients.
Les patients 3, 7, 8, 13 et 17 ont montré une coloration positive
des spirochetes et les deux compatibles avec les sphérules morphologique
formes de Borrelia avec le nitrate d'argent Dieterle
coloration. Ces patients ont également démontré fortement positive
Bb immunocoloration des bactéries dans les échantillons
ainsi que les débris cellulaires environnant, tel que décrit
au dessus. Les données sont résumées dans le tableau 3.
La culture vaginale
Écouvillons de sécrétions vaginales ont été soumis pour la culture
de patients 8, 14, 21 et 24. Les bactéries mobiles étaient visibles
dans le liquide de culture à partir de l'ensemble des quatre patients. La coloration des vaginal
les cultures ont été concentrées par centrifugation suivie d'Dieterle
coloration à l'argent de nitrate et anti-Bb immunocoloration
a été effectuée pour les échantillons prélevés sur des patients et 8
21. Les deux échantillons ont montré une coloration positive à la fois
sphérules et des spirochètes compatibles avec morphologique
formes de Borrelia avec Dieterle nitrate d'argent tache. Les Deux
spécimens démontré immunocoloration Bb fortement positive
des bactéries dans les échantillons, ainsi que la
entourant les débris cellulaires, comme décrit ci-dessus. Les données sont
résumés dans le tableau 3.
L'analyse moléculaire
Détection PCR A. de Borrelia
Divers types d'échantillons de 20 patients ont été soumis
PCR pour la détection de Borrelia dans trois laboratoires indépendants.
Ces échantillons comprenaient dermatologique ensemble
callosités, des coupes histologiques de la peau, la culture de la peau, du sang
culture, les cultures vaginales, et un spécimen de l'intestin
tissu épithélial qui avait mué off dans les selles du patient
lors d'un nettoyage intestinal. gènes de Borrelia été détectés
dans 18 des patients dont les échantillons ont été soumis, et
les résultats étaient équivoques pour 2 patients. des séquences d'amplicon
compatible avec l'ADN de Borrelia ont été obtenus pour la PCR
produits provenant de 14 patients. La séquence de Bb stricto était
confirmée chez 12 patients, alors que le patient 23 se est révélé
avoir une séquence de l'amplicon compatible avec B. miyamotoi
et le patient 24 avait une séquence compatible avec B. garinii.
Ce dernier patient avait contracté la maladie de Lyme en Europe.
Les résultats positifs de la PCR sont résumées dans le tableau 4.
cultures provenant de patients atteints de la peau 6, 9, 13 et 21 ont été soumises
à des tests PCR, et trois des quatre échantillons testés
positif, confirmant la présence de Borrelia dans les cultures.
Le quatrième échantillon de culture (21 patients) avait équivoques
PCR tests utilisant la sonde ARNr 16S, mais testé
utilisant positif de la sonde moléculaire FlaB (voir ci-dessous).
Ainsi tests moléculaires ont confirmé la présence d'entreprises viables
spirochètes de Borrelia dans les quatre échantillons de culture de la peau.
Treponema denticola a été détecté dans la tavelure 5/16 / cal
échantillons envoyés à australiens biologiques. T. était denticola
non détecté dans du sang, cultures vaginales peau ou (données
pas montré).
B. In-situ hybridation de l'ADN
Bb ADN a été détectée par coloration avec le fluorescent
sondes moléculaires FlaB et 740. Des coupes histologiques de
un matériau de cal provenant de patients 2, 3, 10, 11, 13, 15, 19, 20,
22 et des sections de pastilles vaginales de la culture de la peau et / ou
Discussion
Malgré des preuves irréfutables à l'effet contraire, MD continue
être attribué à la folie des parasitoses délirant ou d'infestation
[19-23]. Les études antérieures démontrant Borrelia
spirochètes dans MD échantillons dermatologiques ont impliqué
seul un petit nombre de sujets de l'étude, et donc un
étude impliquant un plus grand nombre de sujets a été nécessaire.
Une des grandes forces de notre étude est que les patients MD
ont été identifiés sur la base de la présence de fibres multicolores
dans les lésions cutanées ou détectable dans la peau intacte.
Certains de nos patients ne souffrent d'neuropsychiatrique
symptômes, et nous ne nient pas que infestation délirante primaire
peut se produire dans de rares cas [1-4]. En sélectionnant seulement
MD patients répondant à nos critères de dermopathie, cependant,
nous avons sans doute exclus infestation délirante primaire
patients de notre étude. Bien que certains patients MD
souffrant de symptômes neuropsychiatriques avec Borrelia associées
filaments intradermiques peuvent prétendre avoir des vers,
parasites ou similaires, la peau ramper et sensations de picotements
que ces patients se sentent couplés avec la peau visible
lésions, de l'anxiété et de la pensée anthropomorphique peuvent entraîner
des plaintes qui sont mal interprétés par les cliniciens
comme un trouble délirant primaire. D'autres patients MD en
notre étude ne avait pas de symptômes neuropsychiatriques et pourtant
eu le même dermopathy de Borrelia associée, de sorte qu'il apparaît
que dans notre cohorte bien définie MD patients ces symptômes,
quand ils se sont produits, sont le résultat plutôt que le
causer de la dermatose infectieuse, comme décrit précédemment
bulbe de les pattes postérieures de bovins [24,25] de talon. Chronique BDD
lésions prolifératives démontrent filaments de kératine, et
l'examen histologique des tissus malades révèle spirochètes
identifié comme Treponema spp. dispersées dans
kératinocytes élargie à travers le stratum spinosum
et papilles dermiques [26-30]. Bien spirochètes sont
cohérente détectée dans les tissus de lésions, coinvolvement
d'autres agents pathogènes bactériens a été proposée comme
un facteur étiologique contribuant [27,28,31,32]. Tréponémique
spirochetes ont été confirmées en tant que les agents étiologiques primaires
lorsque la condition a été dupliqué par infection expérimentale
avec tréponèmes cultivés purs [33,34].
Comme avec BDD, MD filaments ne sont pas des fibres textiles. MD
fibres sont biofilaments d'origine cellulaire humaine produites
par des cellules épithéliales et issus de couches plus profondes de
l'épiderme et la gaine de la racine du follicule pileux [5,9].
La coloration immunohistochimique et histologique a démontré
que ces filaments sont composés multicolores
de collagène et de kératine [6,9]. Ils sont nucléés à la
la base de fixation aux cellules épithéliales adjacentes, et la
les cellules à la base de filament continu sont en apparence
avec les cellules environnantes de la peau [6]. Bien que la cause de
coloration de fibres rouges n'a pas été défini, le bleu
coloration est le résultat de la mélanine pigmentation plutôt
d'un colorant, comme le montre Fontana Masson histologique
coloration [6]. Il n'y a pas de fibres textiles qui sont connus
collagène dans la composition, nucléation à leur base d'attache,
ou bleu pigmentée par la mélanine. Ainsi, la
fibres caractéristiques de MD sont clairement distinctes des textiles
des fibres [6].
Des coupes histologiques de tissus MD dermatologique réagi
avec immunocoloration anti-Bb dans 19/19 de la dermatologique
échantillons soumis pour l'examen histologique. Motile
spirochètes Borrelia ont été cultivées en milieu inoculé
avec des raclures de peau de quatre patients, démontrant ainsi
que les spirochètes de Borrelia dans les lésions MD sont viables. Borrelia
spirochètes ont également été détectés dans les cultures de sang de certains
MD patients dans notre étude, confirmant la borréliose de Lyme. Systémique
Spirochètes caractérisés comme des souches de Borrelia étaient
détectée par PCR et / ou l'hybridation in situ de l'ADN dans le tissu
ou la culture des échantillons provenant 24/25 patients; 15 de ceux-ci
patients avaient produits des gènes de Borrelia détecté dans dermatologique
spécimens et / ou la peau proviennent de cultures
Lésions MD, et amplicons d'ADN provenant de 14 patients étaient
séquencé et confirmé à être des souches de Borrelia. Vaginal
sécrétions provenant de quatre patients ont été cultivées, et trois
isolats ont été identifiés comme des souches de Borrelia par PCR et
hybridation in situ de l'ADN.
Borréliose de Lyme est une infection systémique qui est communément
associée à des manifestations dermatologiques [35]. Étant Donnés
que la plupart des patients sont sérologiquement MD réactif aux antigènes de Bb,
la présence de Lyme spirochetes dans MD dermatologique
lésions est prévisible et soutient un rôle étiologique
de la maladie spirochetal. Bb stricto sensu et BB
lato ont été associées à de nombreuses dermatologique
manifestations, y compris érythème migrant, lymphocytome borrelial,
acrodermatite chronique atrophiante, morphée,
sclérolichen, le lymphome cutané à cellules B, la sclérodermie,
lymphadenosis derme et prurigo pigmentaire [35-38]. Également
il apparaît que MD est associée à la maladie de Lyme dans
un sous-groupe de patients atteints de cette maladie spirochetal [6-8]. Il
est possible que les spirochètes autres que Bb stricto et
complexe lato la Bb, tels que l'agent de la syphilis,
Treponema pallidum, pourrait être responsable de similaire
dans d'autres manifestations patients. À l'appui de cette supposition,
1945 description originale Ekbom des illusions
des parasitoses rapporté que la plupart des patients dans cette
étude ont été diagnostiqués avec la syphilis, reliant ainsi tréponémique
infection avec prurit, ramper et sensations
la croyance d'infestation [39]. En outre, spirochètes tréponémiques
se sont avérés induire la formation de
lésions filamenteux dans des modèles animaux [26 à 30].
Le mécanisme de formation de filament dans MD ne est pas encore
élucidée. Les filaments sont composés de kératine et
collagène et découler de kératinocytes et fibroblastes prolifératives
dans le tissu épithélial humain [6,9]. Bb semble
avoir une prédilection pour les fibroblastes et kératinocytes, et
invasion de ces cellules par des spirochetes Borrelia a été
rapportés [40-42]. Bb semble attacher à des fibroblastes
suivie par l'engloutissement des spirochètes, la formation de
vacuoles et la réplication intracellulaire [42]. Intracellulaire
la séquestration de Bb dans les fibroblastes de la peau et des kératinocytes
peut protéger les spirochètes de mécanismes de défense de l'hôte
[40,41]. Il est donc raisonnable de supposer
que BB infection intracellulaire de kératinocytes et de fibroblastes
peut altérer la kératine et d'expression de collagène et que
la présence de Borrelia spirochetes dans le tissu dermatologique
est un facteur étiologique primaire dans l'évolution de MD
lésions.
Spirochètes Sib viables ont été isolés à partir de lysats
des fibroblastes et kératinocytes traités avec des monocouches
des antibiotiques [40,41]. Par conséquent, en plus de la protection
de défenses de l'hôte, la séquestration dans les fibroblastes et
kératinocytes peuvent protéger Bb de la thérapie antibiotique. Spirochètes
MD en tissus dermatologique de patients et une
12 étaient réactifs à des anti-immunomarquages Bb et Nous avons détecté
ADN de Borrelia dans les tissus provenant de ces dermatologique
deux patients. Ces patients recevaient agressive
antibiothérapie à l'époque de l'étude. Les patients 2, 8,
13, 19 et 20 avaient déjà reçu un traitement antibiotique
la maladie de Lyme, l'infection reste encore eu spirochetal détectable.
Infection persistante réfractaire au traitement antibiotique
peut donc résulter de la séquestration de Borrelia
SPIROCHETES dans les kératinocytes et fibroblastes en MD
des patients.
Bien spirochètes semblent être les étiologique primaire
agents de MD, les preuves suggèrent que l'étiologie
Tableau 5 Détection de l'ADN de Bb par hybridation in situ avec
Sondes d'ADN Bb spécifiques dans les échantillons provenant de Morgellons
patients
Le patient n ° Echantillon Probe Probe 740 FlaB
1 Callus Non effectuée positive
2 Callus Positif Positif
3 Callus Positif Positif
4 Callus Non effectuée positive
La culture de peau 6 Non effectuée positive
7 hémoculture positive Non effectuée
8 Callus Non effectuée positive
10 Callus Positif Positif
11 Callus Positif Positif
12 Callus Non effectuée positive
13 Callus Positif Positif
15 Callus Positif Positif
16 Callus Non effectuée positive
18 Callus Non effectuée positive
19 Callus Positif Positif
20 Callus Positif Positif
La culture 21 de la peau positif non réalisé
21 vaginale culture positive Non effectué
22 Callus positif non réalisé
24 biopsie positive Non effectué
Middelveen et al. BMC dermatologie (2015) 15: 1 Page 11 sur 14
est multifactorielle. Facteurs étiologiques secondaires, telles que
prédominance féminine, la dysfonction immunitaire, et d'autres
co-infections transmises par les tiques semblent jouer un rôle dans le développement
de ce dermopathie [1-5]. Comme indiqué dans le tableau 1,
nous avons trouvé des preuves sérologiques de co-infections transmises par les tiques
y compris Babesia, Anaplasma, Ehrlichia, et Bartonella
Rickettsia spp. dans cinq des six patients qui ont été testés. Le
rôle de ces co-infections dans MD reste indéfini.
Bien que nous avons démontré la présence de Borrelia
SPIROCHETES dans tous les patients dans notre groupe d'étude, T.
denticola a été détectée dans les échantillons dermatologiques
de cinq patients. Le rôle de ces survenant communément
spirochètes orales dans l'évolution des lésions dermatologiques MD
et la formation des filaments ultérieure est incertaine, et
Nous pensons que coinvolvement de ces et peut-être
d'autres agents pathogènes pourraient contribuer ou exacerbant
facteurs MD.
Une étude des Centers for Disease Control and Prevention
(CDC) a conclu que les agents pathogènes ne étaient pas impliqués
MD dans [22]. La recherche d'agents pathogènes spirochetal
dans cette étude a été limitée à coloration Warthin-Starry sur un
petit nombre d'échantillons de tissus et commerciale à deux niveaux
test sérologique de la maladie de Lyme tel qu'interprété par la CDC
Des critères de surveillance de Lyme [22]. Il convient de noter que seulement
deux des patients de notre groupe d'étude étaient positifs pour
La maladie de Lyme en fonction des critères de surveillance CDC Lyme
et pourtant spirochètes Borrelia étaient facilement détectable dans ce
groupe de 25 patients MD.
Le diagnostic de la maladie de Lyme est un sujet controversé
dans la littérature médicale. Les tests sérologiques pour la maladie de Lyme
manquer de sensibilité, et séronégativité a été démontré
chez les patients atteints d'une infection Bb [43,44]. Détection par PCR ne est pas
standardisé, et la sensibilité et la spécificité des tests
varie donc d'un laboratoire à [45,46]. On Y
souches de Borrelia détectés en utilisant différentes amorces et différent
méthodologies et nos résultats montrent que l'amorce
hybridation différait entre les échantillons. De même Borrelia
détection de l'antigène peut ne pas être fiable, et immunocoloration
peut manquer de sensibilité ou de la spécificité [46,47]. Bien que notre
sections de granulés dermatologiques et la culture ont toujours été
réactive avec des anticorps polyclonaux anti-Bb, nous avons
pas certain de la spécificité de notre test. Nous souhaitons
souligner, toutefois, que la répétition de détection de Borrelia
spirochètes utilisant une combinaison de divers laboratoire
méthodes rend les tests faux positifs hautement improbable
ces patients MD.
culture de Borrelia ne est pas disponible dans de nombreux laboratoires
et peut être difficile en raison des exigences de croissance exigeants
et pléomorphisme spirochetal [48,49]. Le
formation de formes sphériques, les formes tronquées, droite
formes, formes ondulées, etc. pourrait entraîner positif
cultures négligées. Nos cultures ont démontré
polymorphisme important et variantes kystique ou tronquées
étaient présents, plus encore dans les cultures de sang que la peau
les cultures. Dans notre expérience identification histologique est
compliqué parce polymorphisme se produit in vivo ainsi
comme in vitro [50,51]. Différences de sensibilité et de spécificité
entre les méthodologies de laboratoire pour détecter Borrelia
spirochètes nécessitent l'utilisation de plusieurs méthodes différentes
pour confirmer la présence de l'infection Borrelia. Si MD
est déterminé à être pathognomonique de la borréliose de Lyme, il
va aider au diagnostic de la maladie de Lyme chez ce groupe de patients.
Une étude récente de l'Australie a trouvé MD chez 6% des patients
un diagnostic de la maladie de Lyme sur ce continent [52].
Nous avons atteint un degré élevé de réussite dans la détection Bb
et étroitement liés spirochètes de MD dermatologique
tissu. Nous attribuons notre succès à plusieurs facteurs clés.
Tout d'abord, comme indiqué précédemment, nous avions un critère diagnostique clair
Cela nous a permis de sélectionner la clinique appropriée
cohorte. Deuxièmement, contrairement à T. pallidum, le tréponème
l'agent de la syphilis, Borrelia spp. peut être mis en culture, ainsi
magnifier leurs numéros in vitro et l'augmentation de la
possibilité pour la détection. Troisièmement, contrairement secondaire et
lésions cutanées syphilitiques tertiaires où sont tréponèmes
rarement détecté, nous avons observé que les lésions portent un MD
spirochetal haute charge qui permet la détection relativement facile,
similaire à lésions observées chez les bovins avec BDD. Au Final,
nous avons utilisé une variété de microscopiques sensibles et moléculaire
méthodologies pour détecter Borrelia spp., y compris moléculaire
hybridation et techniques de PCR qui peut détecter spirochetal
ADN dans la gamme du picogramme.
La détection de Borrelia spirochetes dans dermatologique
échantillons provenant d'un groupe plus large de patients MD Autres Valide
la nature infectieuse de cette dermatose. Comme noté
ci-dessus, T. pallidum spirochètes sont rarement détectés dans
des lésions cutanées syphilitiques secondaires et tertiaires, même lorsque
techniques moléculaires sensibles comme la PCR sont effectués,
encore spirochètes de syphilis sont reconnues pour être
l'agent causal de ces lésions [53-55]. L'utilisation de
un système de classification clinique de la syphilis a aidé
le diagnostic et le traitement de cette tréponémique systémique
l'infection. Contrairement à la syphilis, nous avons pu constamment
isoler et / ou détecter des spirochetes Borrelia à partir de MD
spécimens dermatologiques. De plus, contrairement à la syphilis, pas
existe système de classification clinique MD.
Basé sur notre expérience avec plusieurs centaines de patients MD,
nous proposons un système de classification clinique qui reflète
la durée et la localisation des lésions MD, comme suit:
1. précoce localisées: lésions / fibres présente moins de
trois (3) mois et localisée à un seul domaine de la
corps (tête, tronc, des extrémités).
2. disséminée précoce: lésions / fibres présentes pour moins
de trois (3) mois et impliquant plus d'un
zone du corps (tête, tronc, des extrémités).
3. tardive et localisée: lésions / fibres présent depuis plus de
six (6) mois et localisée à une région du corps
(Tête, tronc, des extrémités).
4. disséminée tardive: lésions / fibres présentes pour plus
de six (6) mois et impliquant plus d'un
zone du corps (tête, tronc, des extrémités).
Le système de classification offre un cadre médical
qui devrait aider à valider et normaliser le diagnostic
du rapport de gestion. D'autres études sont nécessaires pour déterminer si
cette classification aura une importance thérapeutique et pronostique
pour les patients MD.
Conclusions
Nous avons entrepris une microscopique détaillée et moléculaire
étude de patients MD en Amérique du Nord pour enquêter sur la
présence de Borrelia SPIROCHETES systématique et dermatologique
spécimens. Basé sur la culture, l'histologie, l'immunohistochimie,
microscopie électronique moléculaire et
tests, nous présentons des preuves d'infection vaste spirochetal
chez les patients MD. Notre étude confirme que MD est un
vraie maladie somatique associée à la maladie de Lyme. Le
proposé système de classification clinique MD devrait aider
dans le diagnostic et le traitement de cette maladie complexe.
Intérêts concurrents
MJM, PJM et RBS servir sans compensation sur le conseil scientifique
panel de la Fondation Charles E. Holman Morgellons maladie. L'autre
auteurs ne ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.
Les contributions des auteurs
MJM a participé à la conception de l'étude et de la coordination, de la culture réalisée,
histologie et immunohistochimie expériences et rédigé le
manuscrit. CB, JB, ES, KRF, YW et AF effectuées tesing PCR, in situ
hybridation et de séquençage d'ADN expériences. PJM a participé à la
étudier la conception et édité le manuscrit. RBS a participé à l'étude
la conception et la coordination et édité le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et
approuvé le manuscrit final.
Remerciements
Les auteurs remercient les Drs. Stewart Adams, Robert Allan, Gordon Atkins, Robert
Bransfield, George Chaconas, Douglas Demetrick, Dorte Dopfer, Christopher
Hardy, Doug Kahn, Alan MacDonald, Steve McClain, Elizabeth Rasmussen,
Ginger Savely et Janet Sperling de discussion utile. Nous remercions Joel Israël
pour le support technique et la Lorraine Johnson pour examen manuscrit, et nous
sont reconnaissants à Cindy Casey et le E. Holman maladie de Morgellons Charles
Fondation pour le soutien financier.
Source de financement
Un financement partiel pour cette étude a été fourni par le Charles E. Holman
Fondation maladie de Morgellons, Austin, TX, USA. La Fondation fourni
des fonds pour les réactifs d'analyse et pour les frais d'édition. La Fondation ne avait pas
rôle dans une des situations suivantes: la conception de l'étude, la collecte, l'analyse et
l'interprétation des données, rédaction du manuscrit, ou la décision de soumettre
le manuscrit pour publication.
Auteur de détails
1
Lyme international et les maladies associées Société, Bethesda, MD, USA.
2
Département de biologie et sciences de l'environnement, Université du Nouveau-
Haven, West Haven, CT, Etats-Unis. 3
Australiens biologiques, Sydney, NSW, Australie. 4
450 Sutter Street, Suite 1504, San Francisco, CA 94108, USA.
Reçu le 21 Août 2014 Accepté 28 Janvier 2015
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